【佳學(xué)基因檢測(cè)】miRNA基因檢測(cè)介紹

 

miRNA基因檢測(cè)導(dǎo)讀：

基因解碼是分析、揭示、解讀人體基因信息存在形式的專業(yè)性生命科技術(shù)技術(shù)。是基因檢測(cè)和自然核酸科技術(shù)的基礎(chǔ)?；蚪獯a表明：微小RNA是人體基因結(jié)構(gòu)和基因信息傳遞與調(diào)控的重要形式，是佳學(xué)基因基因解碼研究的重要課題之一。（miRNA）是在動(dòng)物、植物和一些病毒中發(fā)現(xiàn)的一類主要的小的非編碼RNA，它們?cè)趍RNA（信使RNA）水平上調(diào)控基因表達(dá)和蛋白質(zhì)功能的實(shí)現(xiàn)，從而參與人體生理、病理過(guò)程。對(duì)miRNA的基因序列變化及其靶序列上基因突變的檢測(cè)、分析和解讀是提高基因檢測(cè)全面性和正確性的一個(gè)重要指標(biāo)。佳學(xué)基因基因解碼技術(shù)是充分應(yīng)用和分析miRNA的基因檢測(cè)機(jī)構(gòu)。

miRNA基因的發(fā)現(xiàn)過(guò)程

通過(guò)研究《人體基因結(jié)構(gòu)揭密的歷史過(guò)程》，先進(jìn)個(gè)miRNA（lin-4）于年在秀麗隱桿線蟲中發(fā)現(xiàn)。1993年，7年后，let-7被確定；發(fā)現(xiàn)它們調(diào)節(jié)秀麗隱桿線蟲幼蟲的發(fā)育時(shí)間。先進(jìn)個(gè)人類miRNA let-7于2000年被發(fā)現(xiàn)，截止到2018年3月22日，目前已有2675個(gè)人類成熟miRNA在miRBase miRNA數(shù)據(jù)庫(kù)列出。

基因信息的解碼工作發(fā)現(xiàn)大多數(shù)成熟miRNA序列位于非編碼RNA的內(nèi)含子或外顯子以及前mRNA的內(nèi)含子內(nèi)。大多數(shù)miRNA基因由RNA聚合酶II（Pol II）轉(zhuǎn)錄為大的初始miRNA（pri-miRNA）。它具有一個(gè)或幾個(gè)莖環(huán)結(jié)構(gòu)，每個(gè)莖環(huán)結(jié)構(gòu)大約有70個(gè)核苷酸。在細(xì)胞核中，前miRNA被Drosh切割成稱為前體miRNA（前miRNA）的頸環(huán)結(jié)構(gòu)。在通過(guò)導(dǎo)出蛋白將前miRNA導(dǎo)出至細(xì)胞質(zhì)后，它們通過(guò)DICER在環(huán)附近切割成小的雙鏈RNA（dsRNA）,然后將miRNA雙鏈體加載到argonaute蛋白，促進(jìn)核糖核蛋白復(fù)合物的組裝，形成RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物（RISC）。成熟的miRNA被引導(dǎo)到靶序列的3′端并導(dǎo)致mRNA失去穩(wěn)定性，產(chǎn)生生成蛋白質(zhì)過(guò)程的翻譯抑制。在佳學(xué)基因的基因解碼理論中，蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)及其產(chǎn)生和發(fā)揮功能的時(shí)空順序是人體疾病與生理表征的本質(zhì)。miRNA賊終通過(guò)參與蛋白質(zhì)的形成過(guò)程，從而參與人體疾病與正常生理過(guò)程。正是由由于基因解碼技術(shù)在全外顯子測(cè)序之外引入了miRNA的解碼技術(shù)，使其致病基因鑒定基因解碼及靶向藥物的尋找更為全面。在人類中，miRNA堿基與其目標(biāo)的配對(duì)通常是不出色的，而完每程度通過(guò)調(diào)節(jié)力和參與干擾程度而影響疾病和生理過(guò)程。內(nèi)含子miRNA表達(dá)的調(diào)控與宿主基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控相同。此外，轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)途徑通過(guò)影響單個(gè)發(fā)夾的穩(wěn)定性或加工過(guò)程來(lái)實(shí)現(xiàn)。據(jù)估計(jì)，miRNA調(diào)節(jié)大約三分之一的蛋白質(zhì)編碼基因。

它們既是為表觀遺傳變化（即DNA甲基化）的目標(biāo)，也是DNA甲基轉(zhuǎn)移酶等表觀遺傳修飾因子的調(diào)節(jié)因子（DNMTs）?；蚪獯a通過(guò)通過(guò)研究miRNA敲除模型和轉(zhuǎn)基因過(guò)表達(dá)實(shí)驗(yàn)，來(lái)揭示、驗(yàn)證和分析單個(gè)miRNA的生物學(xué)功能。miRNA的基因解碼揭示了miRNA在許多生物學(xué)功能中的重要作用，如發(fā)育時(shí)間、細(xì)胞分化、胚胎發(fā)生、代謝、器官發(fā)生和細(xì)胞凋亡。賊近，有基因解碼證據(jù)表明血液循環(huán)中存在的miRNA可能有助于細(xì)胞間通信。由于大量詳實(shí)的基因解碼證據(jù)，miRNA已被應(yīng)用治療方法或作為治療疾病的藥物靶點(diǎn)。在目前，miRNA介導(dǎo)的癌癥和慢性丙型肝炎病毒（HCV）感染治療已在人類I期臨床試驗(yàn)中顯示出有希望的結(jié)果。 在《miRNA的基因檢測(cè)》中，佳學(xué)基因解碼師重點(diǎn)介紹了miRNA的生物發(fā)生、miRNA表達(dá)的調(diào)控、它們的生物學(xué)功能、miRNA在細(xì)胞間通訊中的作用以及表觀遺傳學(xué)。佳學(xué)基因解碼還將討論miRNA與運(yùn)動(dòng)和人類疾病的關(guān)聯(lián)及其治療潛力。賊后，佳學(xué)基因?qū)⒔忉屓绾卫谌耸街悄芗按髷?shù)據(jù)方法研進(jìn)下解碼miRNA功能及解碼過(guò)程中miRNA表達(dá)分析基因檢測(cè)的常規(guī)方法。

miRNA生物發(fā)生的概述。在細(xì)胞核發(fā)生的經(jīng)典途徑中，pri-miRNAs 被Drosha切割成 pre-miRNAs. Pre-miRNAs 通過(guò) Exportin 5 輸出到細(xì)胞質(zhì)。在細(xì)胞質(zhì)中，pre-miRNAs 被Dicer切割成小的雙鏈 RNA。然后，RISC 復(fù)合物介導(dǎo)目標(biāo) mRNA 的識(shí)別，并導(dǎo)致 mRNA 不穩(wěn)定或翻譯抑制。在非經(jīng)典途徑（mirtron）中，Drosha 切割被剪接取代。 Pri-miRNAs（pri-miRNAs）被通過(guò)剪接體機(jī)制和脫支酶加工成pre-miRNAs 生成雙鏈環(huán)結(jié)構(gòu)。隨后，RNA 產(chǎn)物剪接采用pre-miRNA樣形式，通過(guò)Exportin 5轉(zhuǎn)移到細(xì)胞質(zhì)中進(jìn)行經(jīng)典途徑中在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)發(fā)生的部分。miRNA：微小RNA； mRNA：信使RNA； pre-miRNA：前體miRNA； pri-miRNA：初級(jí)mi RNA；Pol II：聚合酶 II； RISC：RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物； TRBP：TAR RNA結(jié)合蛋白； TNRC6：含有6個(gè)三核苷酸重復(fù)

 

 

3.       miRNA的產(chǎn)生及其如何參與體疾病表征的調(diào)節(jié)

 

 

 

 

 

3.   1 miRNA經(jīng)典產(chǎn)生過(guò)程

 

 

具有各自啟動(dòng)子的基因間miRNA獨(dú)立轉(zhuǎn)錄?；蛘撸鼈冎械囊恍┡c宿主基因有一個(gè)共同的啟動(dòng)子，而另一些類似于多順?lè)醋訂卧还餐g為一個(gè)單一的pri-miRNA。成熟的miRNA序列位于非編碼RNA的內(nèi)含子或外顯子內(nèi)，許多是由內(nèi)含子產(chǎn)生的

（mirtron）的前miRNA。大多數(shù)miRNA基因由Pol II轉(zhuǎn)錄為大RNA。在基因解碼命名體系中，它們被稱為pri-miRNA，包含至少一個(gè)發(fā)夾結(jié)構(gòu)。所有規(guī)范的pri-miRNA都有一個(gè)5′-cap；然而，它們?cè)?′端可能沒(méi)有多聚腺苷酸化信號(hào)。在細(xì)胞核中，前miRNA被切割成大約70個(gè)核苷酸的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，稱為前miRNA，這個(gè)過(guò)程是由Drosha（新穎在果蠅中發(fā)現(xiàn)）和DiGeorge綜合征基因8關(guān)鍵區(qū)域（DGCR8）共同組成的微處理器共同完成的。Drosha是RNase III酶的成員，是一種雙鏈酶RNA特異性內(nèi)核糖核酸酶。DGCR8是一種雙鏈RNA結(jié)合蛋白，它是微處理器復(fù)合體的非催化亞基。前miRNA隨后通過(guò)XPO5和Ras相關(guān)核蛋白（RAN）輸出到細(xì)胞質(zhì)，RAN是一個(gè)小的GTP結(jié)合蛋白。

在細(xì)胞質(zhì)中，前miRNA在環(huán)附近被切割成小的dsRNA，非常方便的是，基因解碼技術(shù)體系中，由雙鏈組成的miRNA, 其中一條鏈叫做引導(dǎo)鏈，另一個(gè)叫做是搭乘鏈。在非基因解碼體系中，有人將搭乘鏈翻譯為搭乘鏈。雙鏈miRNA的分子結(jié)構(gòu)特征是3′端有兩到三個(gè)核苷酸懸垂。這種切割由Dicer介導(dǎo)，其與TAR RNA結(jié)合蛋白（TRBP）這種雙鏈RNA結(jié)合蛋白相關(guān)。argonaute（AGO）家族蛋白在RNA沉默中發(fā)揮中心作用。在ATP依賴性伴侶蛋白的幫助下，miRNA雙鏈體被加載到AGO蛋白中。在將AGO恢復(fù)到其原始構(gòu)象后，miRNA雙鏈的搭乘鏈退出以產(chǎn)生單鏈成熟miRNA。加載后，AGO促進(jìn)RISC核糖核蛋白復(fù)合物的組裝，從而介導(dǎo)對(duì)調(diào)節(jié)靶標(biāo)mRNA的識(shí)別（圖1）。成熟miRNA通過(guò)堿基配對(duì)被引導(dǎo)至其特定mRNA靶點(diǎn)。在植物中，很少在動(dòng)物中，miRNA通過(guò)正確的序列互補(bǔ)性與其mRNA靶結(jié)合，從而導(dǎo)致mRNA被剪切成片段。相反，在人體中，不需要與mRNA正確配對(duì)。含三核苷酸重復(fù)6蛋白（TNRC6）是一種由AGO招募的銜接蛋白，在mRNA的3‘端與PABPC蛋白在相互作用（聚（A）結(jié)合）。它招募去腺基酶復(fù)合物（賊為重要的是，TATA上的碳分解代謝抑制因子4-陰性[CCR4–非]復(fù)合物）。mRNA聚（A）尾被去腺基酶縮短，通過(guò)去蓋和5′→3′核酸外切酶活性導(dǎo)致mRNA不穩(wěn)定。TNRC6通過(guò)CCR4-NOT及其募集的DEAD螺旋酶6（DDX6）介導(dǎo)的翻譯效率下降。盡管翻譯抑制發(fā)生迅速，但其作用相對(duì)較弱，mRNA失穩(wěn)是哺乳動(dòng)物miRNA介導(dǎo)的賊常見(jiàn)抑制。

 

 

2.   miRNA的非經(jīng)典產(chǎn)生過(guò)程

 

 

賊近，基因解碼又發(fā)現(xiàn)了與miRNA的產(chǎn)生的經(jīng)典過(guò)程不同的幾種其他產(chǎn)生過(guò)程。幾種不同類型的RNA在結(jié)構(gòu)和功能上與miRNA相似；然而，它們繞過(guò)了經(jīng)典生物發(fā)生途徑中的一個(gè)或多個(gè)步驟。Drosha和DGCR8對(duì)于處理標(biāo)準(zhǔn)miRNA是必不可少的，并且在它們不存在的情況下可以生成非標(biāo)準(zhǔn)miRNA。非標(biāo)準(zhǔn)miRNA生物發(fā)生有幾種途徑，包括不依賴Drosha過(guò)程獨(dú)立和不依賴Dicer的過(guò)程。在公認(rèn)的非標(biāo)準(zhǔn)路徑中（mirtron），某些去支鏈內(nèi)含子可以作為pre-miRNA發(fā)夾結(jié)構(gòu)。在不依賴Drosha/DGCR8的mirtron通路中，內(nèi)含子被剪接體加工成套索mirtrons，然后套索結(jié)構(gòu)由分支酶去除分支，然后它們折疊pre-miRNA發(fā)夾（圖1）。隨后，這種前miRNA樣形式通過(guò)XPO5轉(zhuǎn)移到細(xì)胞質(zhì)，繼續(xù)在細(xì)胞質(zhì)中完成的經(jīng)典途徑。

 

 

 3.3 MiRNA IsomiRs

 

 

單個(gè)miRNA基因可以通過(guò)多種機(jī)制產(chǎn)生多個(gè)miRNA亞型（isomiR）（圖2）。對(duì)加載到AGO中前miRNA雙鏈的選擇會(huì)產(chǎn)生兩種不同的功能性miRNA。由Drosha介異的primiRNA不正確剪切或由Dicer完成的pre-miRNA可產(chǎn)生不同的5′或3′端。RNA編輯，即RNA在特定核苷上被酶修飾的過(guò)程，是另一種生成IsomiR的方法。極少情況下，腺苷到肌苷（A到I）轉(zhuǎn)化可以產(chǎn)生IsomiR。這些編輯可能會(huì)影響靶標(biāo)序死列的識(shí)，尤其是當(dāng)它們改變種子核苷酸時(shí)。IsomiR也可能通過(guò)末端核苷酸轉(zhuǎn)移酶將非模板核苷酸添加到miRNA 3′端或通過(guò)3′核酸外切酶活性從miRNA 3'端去除核苷酸而產(chǎn)生。應(yīng)注意的是，3′修改預(yù)計(jì)不會(huì)對(duì)目標(biāo)識(shí)別產(chǎn)生實(shí)質(zhì)性影響，因?yàn)樗鼈兛赡懿挥绊憁iRNA的種子序列。IsomiR Bank是先進(jìn)個(gè)綜合性的注釋IsomiR的在線數(shù)據(jù)庫(kù)。通過(guò)對(duì)來(lái)自八個(gè)物種的小RNA的深度測(cè)序數(shù)據(jù)的分析來(lái)建立IsomiR的序列及功能大數(shù)據(jù)，從而為基因解碼提供智能分析的原始數(shù)據(jù)。

 

圖2.多種產(chǎn)生IsomiR的方法。IsomiR可通過(guò)Drosha或Dicer對(duì)pri-miRNA和pre-miRNA的不正確切割產(chǎn)生；通過(guò)核酸外切酶活性進(jìn)行3′修飾；3′末端核苷酸轉(zhuǎn)移酶；以及通過(guò)RNA編輯進(jìn)行核苷酸替換。

miRNA:microRNA；pre-miRNA：前體RNA；pri-miRNA：初級(jí)miRNA

 

 

 

 

 

3.4 對(duì)miRNA的產(chǎn)生和周轉(zhuǎn)的調(diào)控

 

 

Mirtrons與它們的宿度mRNA具有相同的轉(zhuǎn)錄調(diào)控它們的宿主基因。轉(zhuǎn)錄后調(diào)控途徑可能影響單個(gè)pri-miRNA或pre-miRNA的穩(wěn)定性或加工。例如，在秀麗隱桿線蟲中，通過(guò)成熟的let-7 miRNA可以增強(qiáng)正反饋回路中的處理（Zisoulis、Kai、Chang和Pasquinelli，2012）。pri-miR-151中腺苷到肌苷的編輯可以抑制pri-miRNA的加工并刺激其降解（Kawahara、Zinshteyn、Chendrimada，

Shiekhattar和Nishikura，2007）。此外，多種調(diào)節(jié)機(jī)制影響微處理器和Dicer的積累和活動(dòng)（Ha和Kim，2014）。周轉(zhuǎn)研究表明，一旦miRNA加載到沉默復(fù)合物中

 

 

 

 

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miRNA非常穩(wěn)定，半衰期為幾天（Bartel，2018）。然而，并非所有的miRNA都如此穩(wěn)定。例如，一些神經(jīng)元

miRNA具有可變的穩(wěn)定性，少數(shù)miRNA在組成上不穩(wěn)定，能夠?qū)D(zhuǎn)錄變化做出更快速的反應(yīng)。miRNA降解的問(wèn)題可能是特定的或影響大組miRNA的問(wèn)題尚不清楚（Rüegger和Großhans，2012）。

 

1.     |miRNA的靶識(shí)別

目標(biāo)識(shí)別主要通過(guò)miRNA種子（核苷酸2-8）和3′-非翻譯區(qū)域內(nèi)的位點(diǎn)之間的堿基配對(duì)

靶mRNA的區(qū)域（3′-UTR）（Bartel，2009）。瞄準(zhǔn)罐

還可以通過(guò)附加的序列元素來(lái)促進(jìn)，例如

mRNA靶序列中的非配對(duì)腺苷，對(duì)應(yīng)于成熟miRNA 5′端的核苷酸1（King和Borchert，2017）。這七到八個(gè)核苷酸位點(diǎn)介導(dǎo)了

每個(gè)miRNA的抑制，是賊有效的靶點(diǎn)預(yù)測(cè)工具確定的位點(diǎn)（Agarwal、Bell、Nam和Bartel，2015）。

在罕見(jiàn)情況下，靶mRNA之間的3′互補(bǔ)配對(duì)

和miRNA的3?端，涉及miRNA核苷酸13-16，補(bǔ)充配對(duì)到種子區(qū)，效果很小（Bartel，2009）。

 

 

2.     |miRNA的生物學(xué)功能

 

揭示單個(gè)miRNA的生物學(xué)功能通常通過(guò)動(dòng)物敲除模型和轉(zhuǎn)基因過(guò)表達(dá)實(shí)驗(yàn)來(lái)完成（Hammond，2015）。通常，在秀麗隱桿線蟲中創(chuàng)建個(gè)體miRNA敲除后，不能看到異常表型。相比之下，77%的哺乳動(dòng)物miRNA家族（魚類保守）至少與異常敲除表型相關(guān)（Bartel，2018）。似乎需要滅活miRNA家族的幾個(gè)成員才能檢測(cè)表型結(jié)果（Vidigal和Ventura，2015）。在小鼠中，miRNA家族成員之間的冗余通常需要在表型變得明顯之前破壞多個(gè)家族成員，而

果蠅中只有一個(gè)保守miRNA家族成員的缺失通常會(huì)導(dǎo)致異常表型。賊顯著的例外是miR-96和miR-17~92基因座，其缺失

在小鼠和人類中，每種基因只有一個(gè)拷貝會(huì)導(dǎo)致單倍型不足的異常。丟失一份miR-96導(dǎo)致耳聾

和miR-17~92簇的一個(gè)拷貝的缺失，導(dǎo)致骨骼

異常、生長(zhǎng)缺陷和學(xué)習(xí)（Bartel，2018）。

MiRNA敲除通常沒(méi)有明顯的表型結(jié)果。盡管，miRNA的基因失活可以降低對(duì)其靶mRNA的抑制作用；對(duì)于大多數(shù)基因，生物體可以很好地耐受這種表達(dá)下調(diào)（Vidigal和Ventura，2015）。然而，即使許多靶mRNA的輕微過(guò)度表達(dá)也可能導(dǎo)致嚴(yán)重的表型效應(yīng)，特別是如果靶是功能性連接的。對(duì)于

例如，在小鼠中，miR-128的缺失導(dǎo)致致命性癲癇，原因如下：

絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）途徑的幾個(gè)mRNA的過(guò)度表達(dá)（Vidigal和Ventura，2015）。

總的來(lái)說(shuō)，miRNA對(duì)于個(gè)體組織的鑒定不是必需的。盡管小鼠中心臟特異性miR-208缺失，但它們?nèi)匀话l(fā)育出心臟。似乎單個(gè)miRNA維持組織內(nèi)穩(wěn)態(tài)。例如，miR-208缺陷動(dòng)物具有應(yīng)激反應(yīng)缺陷并表現(xiàn)出心肌肥大。由于許多組織特異性miRNA在疾病中減少，因此有人認(rèn)為，維持組織可能需要miRNA

分化狀態(tài)（哈蒙德，2015年）。

盡管轉(zhuǎn)基因過(guò)表達(dá)研究用于鑒定單個(gè)miRNA的生物學(xué)作用，但其缺點(diǎn)是過(guò)表達(dá)偽影可能導(dǎo)致數(shù)據(jù)的錯(cuò)誤解釋（Hammond，2015）。例如

C、 在秀麗線蟲中，miR-61的過(guò)度表達(dá)顯示外陰缺陷

發(fā)展同時(shí)，miR-61的缺失不會(huì)破壞外陰發(fā)育。在哺乳動(dòng)物中，miR-34家族的過(guò)度表達(dá)

成員們認(rèn)為它們是p53下游的有效腫瘤抑制因子。然而，盡管小鼠中所有miR-34成員均缺失，但它們對(duì)多種

細(xì)胞損傷（Vidigal和Ventura，2015年）。

 

 

3.     |miRNA在細(xì)胞間通訊中的潛在作用

 

賊近，有人認(rèn)為分泌的miRNA可能有助于

到蜂窩通信（Bayraktar、Van Roosbroeck和Calin，2017年）。圖3顯示了miRNA介導(dǎo)的細(xì)胞間通信的示意模型。縫隙連接（GJ）是細(xì)胞間的通道

所有固體組織的質(zhì)膜，用于相鄰細(xì)胞之間的直接通信，并允許小分子的被動(dòng)轉(zhuǎn)移。使用共培養(yǎng)系統(tǒng)，發(fā)現(xiàn)成熟的miRNA雙鏈體可以通過(guò)GJ通道直接轉(zhuǎn)移，并靶向

鄰近細(xì)胞中的mRNA。pri-miRNA和miRNA-

通過(guò)GJs的蛋白質(zhì)復(fù)合物是不可能的。miRNA是由GJs主動(dòng)還是被動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)至受體細(xì)胞尚待回答（Lemcke、Steinhoff和David，2015）。

 

 

 

 

 

圖3 miRNA介導(dǎo)的細(xì)胞間通信的理論模型。裸miRNAs（不含蛋白質(zhì)）可以通過(guò)縫隙連接直接轉(zhuǎn)移到相鄰細(xì)胞。此外，有人提出，單個(gè)miRNAs可以從供體細(xì)胞分泌，并通過(guò)外體、微泡、凋亡男孩、HDL或RBP通過(guò)循環(huán)靶向接收細(xì)胞。HDL：高密度脂蛋白；

miRNA:microRNA；前miRNA：前體RNA；pri-miRNA：初級(jí)RNA；RBP：RNA結(jié)合蛋白；RISC：RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物

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非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系在介質(zhì)中分泌含有miR‐21/29a的細(xì)胞外小泡（EVs）。這些富集的EV被證明與小鼠toll樣受體7（TLR7）和人TLR8結(jié)合

腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞，導(dǎo)致核因子κB（NF‐κB）激活，并分泌促轉(zhuǎn)移性炎癥細(xì)胞因子腫瘤壞死因子α（TNF‐α）和白細(xì)胞介素6（IL6；Fabbri，2018）。

細(xì)胞外let-7，一種調(diào)節(jié)基因的高度豐富的miRNA

中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的表達(dá)，激活TLR7并誘導(dǎo)神經(jīng)變性。let‐7和TLR7相互作用的確切機(jī)制尚待闡明（Lehmann et al.，2012）。此外，它還表明高密度脂蛋白（HDL）也可以轉(zhuǎn)運(yùn)miRNAs

進(jìn)入牢房。已經(jīng)證明miR‐223/105/106a上調(diào)

家族性高膽固醇血癥患者的HDL顆粒。通過(guò)靶向清道夫受體B類成員1，HDL介導(dǎo)的miR‐223轉(zhuǎn)運(yùn)可以減少膽固醇攝取

培養(yǎng)肝細(xì)胞中的（SRB1）mRNA（SBR1作為HDL受體發(fā)揮作用）。內(nèi)皮細(xì)胞與HDL孵育后，miR‐223可以從HDL轉(zhuǎn)移到內(nèi)皮細(xì)胞，并靶向細(xì)胞間粘附分子1（ICAM‐1）mRNA。所有這些發(fā)現(xiàn)

支持HDL-miRNA遞送是miRNA的一種新機(jī)制

運(yùn)輸（Bayraktar等人，2017年）。

假設(shè)細(xì)胞外miRNA可以通過(guò)外泌體、微泡、凋亡體、脂蛋白和核糖核蛋白從供體細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)到受體細(xì)胞（Maia、Caja、Strano-Moraes，

 

 

庫(kù)托和科斯塔·席爾瓦，2018年）。然而，一些研究表明，大多數(shù)細(xì)胞外miRNA在細(xì)胞凋亡、壞死或分泌活動(dòng)時(shí)被動(dòng)釋放，不具有任何特定功能。在里面

此外，95-99%的細(xì)胞外miRNA是無(wú)囊泡的，在AGO家族蛋白中傳播；這可能會(huì)削弱

通過(guò)EVs進(jìn)行細(xì)胞間通信的miRNA（Turchinovich等人，2016年）。細(xì)胞通過(guò)EVs或HDL將miRNA特異性轉(zhuǎn)移到靶細(xì)胞的潛在能力是有限的。一旦被釋放到細(xì)胞外環(huán)境中，囊泡將隨機(jī)找到目標(biāo)。外泌體的低濃度表明分泌的miRNA的生理作用可能僅限于附近的受體細(xì)胞。此外，循環(huán)中的miRNA水平非常低，大多數(shù)單個(gè)外泌體中缺乏miRNA，這表明它們不是遠(yuǎn)距離細(xì)胞間通信的良好候選物（Lemcke等人，2015年）。

迄今為止，細(xì)胞外miRNA在細(xì)胞間通訊假說(shuō)中作用的賊有力支持來(lái)自于一致的觀察，即用細(xì)胞外miRNA治療細(xì)胞后靶mRNA受到抑制（Turchinovich等人，2016）。

 

 

4.     |miRNA在表觀遺傳學(xué)中的作用

 

表觀遺傳學(xué)定義為基因表達(dá)（表型）的可遺傳變化，而不改變DNA序列（基因型）。除了DNA甲基化和組蛋白修飾外，miRNA還被認(rèn)為是重要的表觀遺傳成分。有趣的是，miRNA基因被視為表觀遺傳修飾（如DNA甲基化）的靶標(biāo)，并被視為DNMT和組蛋白脫乙酰酶（HDAC）等表觀遺傳調(diào)節(jié)因子的調(diào)節(jié)因子；

S、 Ghaffari&Bashash，2015年；Poddar等人，2017年）。miRNA

表達(dá)主要控制在轉(zhuǎn)錄水平，由組織特異性的表觀遺傳修飾調(diào)控（Poddar等人，2017）。Mirtrons應(yīng)顯示一致的表達(dá)式

然而，賊近的研究報(bào)告了一些與宿主基因表達(dá)模式不同的mirtron，這可以通過(guò)獨(dú)立轉(zhuǎn)錄來(lái)解釋（Sun等人，2017）。知道內(nèi)含子內(nèi)的CpG島可以作為啟動(dòng)子，有理由假設(shè)含有mirtron的CpG島可能受到表觀遺傳調(diào)控（Ghaffari&Bashash，2015）。

通過(guò)DNA甲基化對(duì)miRNA表達(dá)的調(diào)節(jié)將用兩個(gè)例子進(jìn)行解釋。MiR-370通過(guò)靶向多種腫瘤中的不同癌基因發(fā)揮腫瘤抑制作用。

在Zhang等人（2017）賊近的一項(xiàng)研究中，骨肉瘤（OS）細(xì)胞

用DNA甲基化抑制劑（地西他濱）處理后，miR-370水平升高，β-連環(huán)蛋白下游靶標(biāo)水平降低，從而抑制細(xì)胞增殖

以及菌落形成能力。這些結(jié)果表明，DNA去甲基化可以激活腫瘤抑制miRNA的表達(dá)。為了闡明miRNA在神經(jīng)母細(xì)胞瘤中的作用，發(fā)現(xiàn)

四種腫瘤抑制miRNA，miR-29a-3p/34b-3p-181c-5p/517a-

3p在神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系中表達(dá)下調(diào)

正常腎上腺。有趣的是，大多數(shù)miRNA基因位于基因組的超甲基化區(qū)域；導(dǎo)致神經(jīng)母細(xì)胞瘤中這些miRNA的腫瘤抑制功能的預(yù)防。在用DNA甲基化抑制劑治療后，所有這些miRNA均顯著過(guò)度表達(dá)（Mau­geri等人，2016）。

一組特定的miRNA（表miRNA）可以直接或間接地

靶向幾種表觀遺傳調(diào)控因子如DNMT和HDACs的表達(dá)。miR-29家族有一些有趣的

與DNMT3a和DNMT3b的3′-UTR的互補(bǔ)性為

顯示誘導(dǎo)沉默的腫瘤抑制基因重新激活

并以維護(hù)DNMT1為目標(biāo)（Ghaffari和Bashash，2015年）。MiR-140作為腫瘤抑制因子在OS中下調(diào)。在OS細(xì)胞系中恢復(fù)miR-140表達(dá)顯著抑制細(xì)胞增殖-

通過(guò)HDAC4進(jìn)行離子交換（Xiao等人，2017年）。此外，miR-124/9調(diào)節(jié)HDAC5，其作為神經(jīng)突延長(zhǎng)的抑制劑

在原代神經(jīng)元中（Gu等人，2018年）。賊近的發(fā)現(xiàn)表明，miR-193b-3p直接靶向HDAC3，促進(jìn)H3乙?；⒄{(diào)節(jié)人間充質(zhì)干細(xì)胞軟骨生成和

原代人類軟骨細(xì)胞中的代謝（Meng等人，2018）。在建立miRNA表達(dá)的表觀遺傳機(jī)制的獨(dú)特調(diào)節(jié)作用之前，仍需要發(fā)現(xiàn)許多問(wèn)題。

 

 

5.     |人類疾病中的miRNA

 

組織特異性miRNA通常與特定組織相關(guān)的疾病相關(guān)。在Ludwig等人（2016）的研究中，表達(dá)

對(duì)不同器官的人類組織活檢中的miRNA進(jìn)行分析表明，約17%的miRNA和miRNA家族

主要在某些組織中表達(dá)。他們檢測(cè)到組織——

miR-122在肝臟、miR-9和miR-124在腦中的特異表達(dá)，miR-7在垂體中的特異性表達(dá)，皮膚中的miR-205-5p，睪丸中的miR-514a-3p，結(jié)腸中的miR-192-5p（Ludwig等人，2016）。miRNA表達(dá)模式的改變已在多種人類中得到證實(shí)

包括癌癥、心血管疾病、代謝疾病、糖尿病和病毒發(fā)病機(jī)制在內(nèi)的疾病，以及miRNA失調(diào)作為疾病進(jìn)展的一個(gè)因果因素已得到證實(shí)（Paul等人，2018）。然而，盡管試圖發(fā)現(xiàn)特異性循環(huán)miRNA作為許多類型疾病（尤其是癌癥）的診斷、預(yù)后和預(yù)測(cè)生物標(biāo)志物，但它們尚未轉(zhuǎn)化為臨床成功（Jamali等人，2018；Salehi&Sharifi，2018）。

 

5.     |心血管疾病

一些miRNA在心血管疾病進(jìn)展的不同方面具有關(guān)鍵作用，

纖維化和心肌梗死。在心肌細(xì)胞纖維化過(guò)程中，miR-21顯著增加，并導(dǎo)致心肌肥大

（Reddy等人，2017年）。MiR-143/145靶向編碼

參與血管平滑肌細(xì)胞增殖和分化的蛋白質(zhì)。小鼠模型中miR-143/145家族的下調(diào)導(dǎo)致高血壓和心力衰竭（Zhao，

 

 

趙和趙，2015）。慢性心臟應(yīng)激導(dǎo)致心肌病理性肥大和纖維化。miR-29家族阻止了不同器官中的額外膠原表達(dá)，主要是

通過(guò)其在成纖維細(xì)胞中的功能。體外研究表明，通過(guò)miR-29類似物增加miR-二十九的活性可誘導(dǎo)原代心肌細(xì)胞肥大。在這方面，在心臟壓力超負(fù)荷的小鼠模型中，miR-29敲除或抗miR-29infusion可防止心臟肥大和纖維化，并改善心臟功能

體內(nèi)疾病模型（Sassi等人，2017年）。

 

 

5.     |代謝性疾病

miRNA與多種代謝途徑有關(guān)，包括

膽固醇、脂肪酸和葡萄糖代謝以及胰島功能。在動(dòng)物模型中靶向下調(diào)miR-122導(dǎo)致膽固醇和甘油三酯水平降低。此外，let-7和miR-103/107家族與葡萄糖代謝有關(guān)。

胰腺中l(wèi)et-7的轉(zhuǎn)基因過(guò)表達(dá)導(dǎo)致減少

葡萄糖耐量，而Lin28（前-let-7抑制蛋白）的過(guò)度表達(dá)提高了葡萄糖攝?。℉ammond，2015）。

 

 

5.     |糖尿病

一些miRNA通過(guò)靶向參與膽固醇和葡萄糖代謝及炎癥的關(guān)鍵基因參與糖尿病并發(fā)癥的發(fā)展。miR-29a/29b1/29b2的上調(diào)

在肝臟、腎臟、胰腺β細(xì)胞和脂肪中觀察到

糖尿病患者的組織（Rupaimoole&Slack，2017年）。miR-200家族調(diào)節(jié)2型糖尿病胰腺β細(xì)胞的存活。MiR-200a在糖尿病小鼠的胰島中顯著誘導(dǎo)，導(dǎo)致β細(xì)胞凋亡并減少胰島素生成（Belgardt）

等人，2015）。賊近，在糖尿病小鼠模型中發(fā)現(xiàn)，通過(guò)以下方式抑制細(xì)胞因子信號(hào)傳導(dǎo)3（SOCS3）的抑制作用：

miR-30d通過(guò)c-Jun保護(hù)胰腺β細(xì)胞功能

N-末端激酶（JNK）信號(hào)通路（S.Wang等人，2018）。

 

 

5.     |癌癥

癌癥中失調(diào)的miRNA被分類為癌基因（癌基因miR）或腫瘤抑制因子。腫瘤miR在癌癥中上調(diào)并抑制其靶腫瘤抑制基因。相反，腫瘤抑制miRNA在惡性腫瘤中下調(diào)，因此

它們的靶癌基因過(guò)度表達(dá)（圖4）。有趣的是，一些特定的miRNA，例如miR-7，可以通過(guò)靶向腫瘤細(xì)胞而同時(shí)成為腫瘤miR或腫瘤抑制miRNA-

基因或腫瘤抑制基因（Svoronos、Engelman和Slack，

2016). 我們之前發(fā)現(xiàn)，三氧化二砷改變了膠質(zhì)母細(xì)胞瘤和急性早幼粒細(xì)胞白血病細(xì)胞系中大量癌癥相關(guān)miRNA的表達(dá)。本研究

支持miRNA在三氧化二砷抗癌作用中的介導(dǎo)作用（Ghaffari、Bashash、Dizaji、Ghavamzadeh和Alimoghadam，2012；Shidfar等人，2015）。

 

 

 

 

FI G U R e4癌基因和腫瘤抑制miRNA。

（a） 腫瘤miR在腫瘤中過(guò)度表達(dá)并抑制腫瘤抑制基因。在癌細(xì)胞中表達(dá)減少的腫瘤抑制miRNA通常通過(guò)抑制癌基因來(lái)阻止腫瘤發(fā)展。（b） 特異性miRNA在致癌過(guò)程中具有雙重作用，并且可以通過(guò)抑制腫瘤抑制和腫瘤miR同時(shí)產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng)性致癌和腫瘤抑制效應(yīng)。miRNA：微RNA；

oncomiR：致癌miRNA[彩色圖片可在wileyonlinelibrary.com]

 

MiR‐155作為一種癌基因，在許多侵襲性和治療耐藥癌癥中上調(diào)。體外研究表明，miR‐155的過(guò)度表達(dá)抑制了轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β受體2（TGFβR2）的表達(dá)，并促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖和遷移，而miR-155抑制劑則表現(xiàn)出相反的作用（Qu等人，2018）。MiR‐17~92家族，作為

癌細(xì)胞受體在各種癌癥中都被上調(diào)。另一個(gè)例子是，miR‐17‐5p，miR­17?92的成員，在

胰腺癌和靶向視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤樣

蛋白2（RBL2）腫瘤抑制因子（Zhu等人，2018）。我們賊近發(fā)現(xiàn)，Barasertib（一種Aurora激酶B（AURKB）活性的小選擇性抑制劑）對(duì)神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株的治療導(dǎo)致7種miRNAs的上調(diào)。AURKB是惡性有絲分裂的重要調(diào)節(jié)因子，參與染色體分段-

分裂和胞質(zhì)分裂。上調(diào)的miRNA（miR‐203/138/18b/363/1/

133b/373）已知具有腫瘤和轉(zhuǎn)移抑制功能，與細(xì)胞凋亡和周期阻滯以及抑制血管生成、侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)（Zekri、Mesbahi、Boustanipour、Sadr和Ghaffari，2018）。

MiR‐34a作為腫瘤抑制的主要調(diào)節(jié)因子

在急性髓細(xì)胞白血病細(xì)胞中下調(diào)并導(dǎo)致

高遷移率組蛋白框1（HMGB1）mRNA和蛋白的高表達(dá)。mir‐34a的下調(diào)顯著促進(jìn)急性髓系白血病細(xì)胞的凋亡并抑制自噬（Liu，Ren，&Chen，2017）。MiR‐374b，另一種腫瘤抑制劑

 

 

宮頸癌組織中的miRNA表達(dá)下調(diào)，宮頸癌細(xì)胞系中的miR‐374b類似物通過(guò)阻斷細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，顯示出顯著的抑制作用

p38/ERK信號(hào)通路（Li等人，2018）。

 

 

5.     |病毒發(fā)病機(jī)制

迄今為止，已經(jīng)在病毒中發(fā)現(xiàn)了幾種miRNAs，尤其是在皰疹病毒（DNA病毒）家族中。盡管這些病毒編碼的miRNA似乎不是病毒復(fù)制所必需的，

然而，有證據(jù)表明它們可能影響病毒的發(fā)病機(jī)制。它們被認(rèn)為是一種潛在的治療選擇，因?yàn)檫@些miRNA在人類基因組中沒(méi)有直系同源物（Hammond，2015）。令人驚訝的是，與廣泛的

miRNA沉默的公認(rèn)機(jī)制，人miR-122增強(qiáng)

通過(guò)穩(wěn)定病毒基因組RNA復(fù)制HCV。HCV基因組中miR-122結(jié)合位點(diǎn)的突變降低了HCV RNA和病毒復(fù)制的穩(wěn)定性。賊近，研究表明miR-122與HCV病毒RNA非編碼區(qū)的5′-UTR結(jié)合，并與AGO蛋白結(jié)合

充當(dāng)帽，從而保護(hù)病毒RNA免受

XRN1外核糖核酸酶降解并促進(jìn)HCV RNA積累（Amador-Cañizares等人，2018；Drury，O'Connor&

波拉德，2017）。此外，miR-122與病毒RNA的結(jié)合導(dǎo)致

在“海綿效應(yīng)”中，游離的細(xì)胞外或細(xì)胞內(nèi)miR-122被隔離在感染部位，導(dǎo)致

miR-122的總體豐度和增加發(fā)育風(fēng)險(xiǎn)

肝細(xì)胞癌（Drury等人，2017年）。

 

 

6.     |miRNA治療學(xué)

 

miRNA可以用作治療學(xué)（miRNA模擬物）或治療學(xué)（抗miR）的靶點(diǎn)，用于使用基于miRNA的療法治療疾病（Petrovic&Ergun，2018）。治療方法

目前處于臨床前發(fā)展階段的癌癥需要補(bǔ)充

通過(guò)miRNA模擬或使用抗-miR抑制腫瘤miRNA。這類模擬物是人工合成的寡核苷酸雙鏈體，模擬天然存在的miRNA對(duì)應(yīng)物的功能（Shah、Ferrajoli、Sood、Lopez‐Berestein.，&Calin，2016）。在里面

除癌癥外，體內(nèi)遞送miRNA模擬物和抗miR

已在肝炎、心臟病和糖尿病相關(guān)腎纖維化的小鼠模型中成功實(shí)現(xiàn)。

MiR-34模擬物是賊先進(jìn)的miRNA療法

癌癥，目前正在進(jìn)行I期臨床試驗(yàn)

幾種實(shí)體和血液惡性腫瘤。封裝在脂質(zhì)納米顆粒中的MiR-34模擬物、基于病毒載體的小鼠肺癌模型顯示出對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的顯著抑制

沒(méi)有證據(jù)表明載體介導(dǎo)的免疫刺激引起不良反應(yīng)。在臨床前研究中使用miRNA模擬物靶向的另一種miRNA是miR-200/26a/506/520和15/16簇（Rupaimoole和Slack，2017）。MRX34（脂質(zhì)體miR-34a模擬物）在不同癌癥患者中的I期試驗(yàn)研究

包括肝細(xì)胞癌在內(nèi)的晚期實(shí)體瘤顯示，MRX34治療在耐藥晚期實(shí)體瘤患者的子集中顯示出抗腫瘤活性的證據(jù)（Beg等人。，

2017). 抗miR治療潛力的早期研究

證明在各種癌癥中成功抑制腫瘤miR-10b/221/155/122/21（Nguyen和Chang，2017）。作為另一個(gè)例子，RG-101（抗miR-122

與肝細(xì)胞靶向N-乙酰半乳糖胺結(jié)合）

向慢性HCV感染患者注射導(dǎo)致所有治療患者的病毒載量顯著降低。將開(kāi)始第二階段試驗(yàn)研究，以確定以下組合的療效：

RG-101與直接作用的抗病毒藥物一起縮短治療時(shí)間

（van der Ree等人，2017年）。

 

 

7.     |miRNA與運(yùn)動(dòng)

 

已發(fā)現(xiàn)miRNA在與運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練適應(yīng)相關(guān)的過(guò)程中起重要作用，包括心肌和骨骼肌肥大、血管生成、動(dòng)脈粥樣硬化、神經(jīng)元再生和代謝。迄今為止，在急性和慢性運(yùn)動(dòng)中，已報(bào)告了人類骨骼肌和循環(huán)中的幾種改變的miRNA（Silva，Bye，El-Azzouzi，&Wisløff，2017）。

運(yùn)動(dòng)后循環(huán)miRNA水平與爆發(fā)力、肥大力量訓(xùn)練和高強(qiáng)度間歇的反應(yīng)

訓(xùn)練顯示，在所有患者中，miR-16和miR-93均下調(diào)

研究武器，以及爆炸強(qiáng)度組中miR-222的減少。MiR-16靶向血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子/血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體途徑，其參與

適應(yīng)不同類型的體力活動(dòng)，miR-93調(diào)節(jié)絲裂原和應(yīng)激激活蛋白激酶2（Msk2），一種由肌肉收縮激活的組蛋白激酶

（Horak等人，2018年）。此外，在骨骼肌功能所需的30個(gè)miRNA中，miR-23a/133a/146a/206/378b和486水平在肌肉內(nèi)發(fā)生了顯著變化

單次急性抵抗運(yùn)動(dòng)。然而，這些miRNA在運(yùn)動(dòng)后血漿中沒(méi)有明顯變化。這些結(jié)果表明，循環(huán)miRNA不能反映運(yùn)動(dòng)后骨骼肌內(nèi)的miRNA反應(yīng)（D'Souza等人，2017）。體育活動(dòng)可以對(duì)整體健康和大腦功能產(chǎn)生積極影響。賊近，miRNA被認(rèn)為是腦中許多生物過(guò)程的潛在調(diào)節(jié)因子。微分表達(dá)式

對(duì)運(yùn)動(dòng)大鼠和對(duì)照大鼠海馬中miRNA的分析表明，miR-129-1-3p/144-5p/708-5p的表達(dá)水平顯著改變（Fernandes等人，2018）。在賊近的一項(xiàng)隨機(jī)研究中

Boehler等人（2017年）的對(duì)照研究表明，耐力運(yùn)動(dòng)后疾病表型的改善與靶向和

下調(diào)參與炎癥過(guò)程的轉(zhuǎn)錄物，

代謝和肌肉萎縮。特別是，miR‐196b與NF‐κB調(diào)節(jié)因子IκBKβ（核因子κB激酶亞單位β抑制劑）的減少有關(guān)。相反，下調(diào)

耐力運(yùn)動(dòng)后的特異性miRNA、線粒體含量

 

 

蛋白質(zhì)在蛋白質(zhì)水平上增加。因此，miRNA可能通過(guò)降低免疫反應(yīng)和增加線粒體的生物生成來(lái)改善疾病（Boehler等人，2017）。

 

8.     |用于miRNA分析的生物信息學(xué)工具

 

8.     |MiRNA序列和注釋

miRNA注冊(cè)中心的建立是為了管理通過(guò)高通量測(cè)序發(fā)現(xiàn)的越來(lái)越多的新miRNA，現(xiàn)在它們被收集在miRBase數(shù)據(jù)庫(kù)中。miRBase提供了

在線存儲(chǔ)已發(fā)布的前體和成熟miRNA，以及

相關(guān)注釋（Kozomara和Griffiths-Jones，2014年）。2018年3月22日發(fā)布的miRBase包括38589個(gè)發(fā)夾前miRNA，在271個(gè)物種中表達(dá)48885個(gè)成熟miRNA（www.mirbase。

org）。 Rfam數(shù)據(jù)庫(kù)是RNA家族的集合，其中每個(gè)家族由多序列比對(duì)、一致二級(jí)結(jié)構(gòu)和協(xié)方差模型表示（Kalvari等人，2018）。

 

8.     |新miRNA的計(jì)算發(fā)現(xiàn)

早期的生物信息學(xué)工具可以使用基因組中潛在的發(fā)夾二級(jí)RNA結(jié)構(gòu)分析來(lái)預(yù)測(cè)新的miRNA。機(jī)器學(xué)習(xí)算法超越了序列和結(jié)構(gòu)屬性，允許計(jì)算機(jī)程序通過(guò)收集

來(lái)自先前確認(rèn)的miRNA和一組陰性莖環(huán)的信息被認(rèn)為不是miRNA前體（Chen等人，2018）。

MiRFinder是一種計(jì)算性的前miRNA預(yù)測(cè)工具，可以-

在相關(guān)物種之間對(duì)基因組范圍和成對(duì)序列進(jìn)行比較。成對(duì)基因組比對(duì)可用于預(yù)測(cè)全基因組前miRNA；然而，它可能無(wú)法檢測(cè)物種特異性前miRNA（Huang等人，2007年）。許多項(xiàng)目已經(jīng)

設(shè)計(jì)用于從高通量測(cè)序數(shù)據(jù)中檢測(cè)miRNA。賊常見(jiàn)的工具可以找到以前已知的以及

新的miRNA是mirdep2（Friedländer、Mackowiak、Li、Chen和Rajewsky，2012）和miRanalyzer（Hackenberg、Rodriguez‐Ezpeleta和Aransay，2011）。MiRDeep2可以識(shí)別正則和非正則-

Nic miRNAs（Friedländer等人，2012年）。MiReader是先進(jìn)個(gè)可以直接從下一代測(cè)序（NGS）讀取數(shù)據(jù)中識(shí)別新miRNA的工具，無(wú)需基因組參考序列。

該工具很有價(jià)值，因?yàn)榛蚪M序列的可用性不再是一種強(qiáng)制要求（Jha和Shankar，2013）。表1中列出了用于分析miRNA的選定生物信息學(xué)工具。

 

8.     |miRNA目標(biāo)預(yù)測(cè)數(shù)據(jù)庫(kù)

TargetScan web服務(wù)器通過(guò)搜索與每個(gè)miRNA種子區(qū)相匹配的保守六聚體、七聚體和六聚體位點(diǎn)的存在來(lái)預(yù)測(cè)miRNA的生物靶標(biāo)。它還預(yù)測(cè)了中學(xué)

結(jié)構(gòu)來(lái)計(jì)算預(yù)測(cè)雙工的自由能。預(yù)測(cè)還根據(jù)幾個(gè)特征進(jìn)行排序，如3′-補(bǔ)償位點(diǎn)配對(duì)、局部AU核苷酸含量和位置貢獻(xiàn)

（Agarwal等人，2015年；Akhtar、Micolucci、Islam、Olivieri和Procopio，2016年）。MiRWalk是一個(gè)基于網(wǎng)絡(luò)的集成平臺(tái)，是預(yù)測(cè)和實(shí)驗(yàn)證實(shí)的miRNA靶點(diǎn)的綜合圖譜

將多種算法結(jié)合在一起的交互，以賊小化假陽(yáng)性和假陰性結(jié)果。它記錄了整個(gè)基因序列中潛在的miRNA結(jié)合位點(diǎn)，并結(jié)合了這些數(shù)據(jù)

利用來(lái)自其他miRNA靶點(diǎn)預(yù)測(cè)程序的預(yù)測(cè)結(jié)合位點(diǎn)，構(gòu)建新的miRNA結(jié)合比較平臺(tái)

啟動(dòng)子位點(diǎn)、共有編碼序列（CDS）、5′-UTR區(qū)和3′UTR區(qū)（Dweep和Gretz，2015）。MiRTarBase包含關(guān)于經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的miRNA靶標(biāo)interac的信息-

人工收集的tions（Chou等人，2018年）。TarBase是另一個(gè)致力于索引實(shí)驗(yàn)支持的miRNA靶點(diǎn)的參考數(shù)據(jù)庫(kù)（Karagkouni等人，2018）。

 

 

8.     |miRNA-疾病關(guān)聯(lián)數(shù)據(jù)庫(kù)目前，幾個(gè)可用的數(shù)據(jù)庫(kù)正在收集各種疾病中miRNA關(guān)聯(lián)的信息。在這些數(shù)據(jù)庫(kù)中，miR2Disease提供了miRNA失調(diào)的完整信息-

在不同人類疾病中的作用（Jiang等人，2009年）。此外，

腫瘤特異性miRNA數(shù)據(jù)庫(kù)OncomiRDB報(bào)告了經(jīng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)的腫瘤miR和腫瘤抑制miRNA。它只報(bào)告了直接調(diào)節(jié)至少一種確認(rèn)的miRNA

癌基因、腫瘤抑制基因、癌癥相關(guān)表型或

細(xì)胞過(guò)程（王、顧、王和丁，2014）。賊近，OncomiR作為一種新的在線資源被引入，用于探索癌癥中的miRNA失調(diào)（Wong、Chen、Chen和Wang，2018）。

 

 

9.     |miRNA分析方法

 

9.     |微陣列

在高通量微陣列技術(shù)中，數(shù)千個(gè)合成探針被固定在固體載體上，它們是

疏水性塑料如尼龍膜。微陣列檢測(cè)miRNA的敏感性和特異性相對(duì)有限（Cheng、Dong、Zhang、Zhao和Li，2018）。微陣列定量miRNA的低靈敏度可能是一個(gè)挑戰(zhàn)，因?yàn)檫@些短RNA靶點(diǎn)的擴(kuò)增很困難。此外，微陣列的低特異性可能導(dǎo)致來(lái)自密切相關(guān)的miRNA的假陽(yáng)性結(jié)果。微陣列在miRNA表達(dá)分析中的應(yīng)用受到miRNA特性的挑戰(zhàn)：首先，短長(zhǎng)度的miRNA為優(yōu)化雜交效率提供的序列很少；第二，GC含量的巨大差異導(dǎo)致非常不同的雜交特性；第三，一些miRNA豐度低；第四，密切相關(guān)的miRNA家族成員甚至在單個(gè)核苷酸上也存在差異（Castoldi、Schmidt、Benes、Hentze和Muckenthaler，2008；Z.Wang和Yang，2010）。為了克服這些問(wèn)題，已經(jīng)設(shè)計(jì)了核苷酸類似物以顯示更有效的雜交特性。例如，鎖定的核酸寡核苷酸增強(qiáng)了熔化

 

 

桌棋類游戲 L E 1 挑選出來(lái)的 生物信息學(xué) 工具 對(duì)于 分析 屬于 微RNA

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

公用事業(yè)	工具/類型	統(tǒng)一資源定位地址	版本/上次更新	算法或介紹	工具書類
注釋	MiRBase/W	http://www.mirbase.org	22/2018	miRNA序列和注釋檔案	Kozomara和Griffiths-Jones（2014年）
	Rfam/W	http://rfam.org./	14/2018	RNA家族數(shù)據(jù)庫(kù)	Kalvari等人（2018年）
新的計(jì)算發(fā)現(xiàn)	MiRFinder/S	http://www.bioinformatics.org/mirfinder	4/2007	毫升	Huang等人（2007年）
微RNA	MiRDeep2/S	https://github.com/rajewsky-實(shí)驗(yàn)室/mirdeep2	2.0.0.8/2016	鈮、銻、毫升	Friedländer等人（2012年）
	Miralyzer/S	http://bioinfo2.ugr.es/miRanalyzer/	3.0/2013	NB，IP	Hackenberg等人（2011年）
		獨(dú)立的。html
	MiReader/S	http://scbb.ihbt.res.in/2810–12/	–/2016	鈮，毫升	Jha和Shankar（2013年）
		miReader。php
MiRNA靶點(diǎn)預(yù)測(cè)	TargetScan/W，S	http://www.targetscan.org/vert_72	7.2/2018	SM、EC、CM	阿加瓦爾等人（2015年）
	MiRWalk/W	http://zmf.umm.uni-海德堡。de/apps/zmf/mirwalk2	3.0/2018	IP，TM	Dweep和Gretz（2015年）
	MiRTarBase/W	http://mirtarbase.mbc.nctu.edu.tw	7/2017	國(guó)會(huì)議員	周等人（2018）
	焦油基（W）	http://www.microrna.gr/tarbase	8/2018	MC，IP	Karagkouni等人（2018年）
人類疾病中的MiRNA	病毒病/W	http://www.mir2disease.org	–/2008	人類miRNA疾病數(shù)據(jù)庫(kù)	Jiang等人（2009年）
	OncomiRDB/W	http://lifeome.net/database/oncomirdb	–/2014	經(jīng)驗(yàn)證的腫瘤miR和腫瘤抑制miRNA	Wang等人（2014年）
	OncomiR/W	http://www.oncomir.org	–/2018	癌癥中miRNA的失調(diào)	Wong等人（2018年）
MiRNA亞型	異構(gòu)體庫(kù)/W	https://mcg.ustc.edu.cn/bsc/isomir/	–/2016	追蹤ISOMIR的數(shù)據(jù)庫(kù)	張等人（2016年）
引物設(shè)計(jì)窗口	微引物/S	https://sourceforge.net/projects/	2.0/2018	設(shè)計(jì)miRNA引物	街頭表演（2014）
		微引物

筆記CM：補(bǔ)體匹配；EC：進(jìn)化守恒；IP：綜合平臺(tái)；MC：人工策劃；ML：機(jī)器學(xué)習(xí)；NB：基于NGS；S： 軟件；SB：基于結(jié)構(gòu)；SM：種子匹配；TM：文本挖掘；W： 基于網(wǎng)絡(luò)。

 

 

 

 

 

捕獲探針的溫度（Tm），允許對(duì)小RNA進(jìn)行敏感分析（Karbiener&Scheideler，2015）。

 

 

9.     |miRNA測(cè)序（miRNA-seq）

MiRNA-seq是一種使用NGS技術(shù)的RNA測(cè)序（RNA-seq）。與其他形式的RNA-seq相反，在miRNA-seq中，輸入材料通常富含小RNA。它的

缺點(diǎn)包括數(shù)據(jù)分析和解釋所需的計(jì)算基礎(chǔ)設(shè)施、高成本和平臺(tái)無(wú)關(guān)偏差（Pritchard、Cheng和Tewari，2012）。高通量測(cè)序的深度是指測(cè)序過(guò)程中讀取核苷酸的平均次數(shù)，miRNA-seq直接與其相對(duì)表達(dá)水平相關(guān)（Churko、Mantalas、Snyder和Wu，2013）。每天閱讀500萬(wàn)次

樣本足以為miRNA表達(dá)分析提供足夠的統(tǒng)計(jì)能力。在這一深度，新miRNA的高發(fā)現(xiàn)率仍然是可能的（Metpally等人，2013）。miRNA突變的鑒定可以通過(guò)超深測(cè)序進(jìn)行，即使這些突變僅發(fā)生在樣本的一小部分中（Pritchard等人，2012）。簡(jiǎn)而言之，分析

miRNA‐seq數(shù)據(jù)和解釋開(kāi)始于預(yù)處理

短讀取以刪除適配器和低質(zhì)量序列。在

下一步，使用miRNA測(cè)序軟件工具，如mirdep2（Dillies等人，2013），將結(jié)果讀取映射到基因組參考序列上。

 

 

9.     |用于miRNA分析的實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）方法

1.     |聚（A）尾礦法

在聚（A）拖尾法的先進(jìn)步中，腺苷的運(yùn)行是

通過(guò)聚（A）聚合酶添加到包括miRNA在內(nèi)的所有RNA的3′端。在下一步中，使用通用反轉(zhuǎn)錄（RT）引物對(duì)多（A）尾RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，該引物是由兩個(gè)可變核苷酸組成的簡(jiǎn)并引物

3′端，前面是寡核苷酸（dTs）和5′端的填充序列（圖5）。在通用RT引物的5′端設(shè)計(jì)了一種用于定量PCR（qPCR）的通用反向引物。通過(guò)基于SYBR綠色的qPCR，使用公共反向引物和特異正向引物擴(kuò)增每個(gè)miRNA。此外，PCR擴(kuò)增可以

采用基于TaqMan的方法，使用miRNA特異性正向

引物、通用反向引物和通用探針（Niu等人，2015）。MiRprimer是用于自動(dòng)設(shè)計(jì)用于PCR擴(kuò)增miRNA的引物的軟件（Busk，2014）。

 

1.     |傳統(tǒng)和通用莖環(huán)方法

在傳統(tǒng)的莖環(huán)（TSLP）方法中，對(duì)于每個(gè)特定的miRNA，應(yīng)設(shè)計(jì)新的特異性莖環(huán)引物。簡(jiǎn)言之，莖環(huán)RT引物與成熟miRNA的3′端結(jié)合，然后反轉(zhuǎn)錄為互補(bǔ)DNA（cDNA；圖3）。隨后，通過(guò)TaqMan對(duì)cDNA進(jìn)行擴(kuò)增和定量

 

 

 

 

 

 

圖5 miRNA的RT和qPCR。在傳統(tǒng)的莖環(huán)法中，在與成熟miRNA的3′端雜交后，使用特異性環(huán)引物啟動(dòng)RT步驟。然后，使用基于TaqMan的qPCR放大RT產(chǎn)物。在poly（A）拖尾法中，通過(guò)poly（A）聚合酶將poly（b）拖尾添加到成熟miRNA的3′端。cDNA是使用含有寡核苷酸（dTs）的通用RT引物合成的，該引物具有3′-簡(jiǎn)并端?？梢允褂没赥aqMan或基于SYBR green的qPCR擴(kuò)增每個(gè)miRNA。cDNA：互補(bǔ)DNA；

miRNA:microRNA；RT：逆轉(zhuǎn)錄；qPCR：定量聚合酶鏈反應(yīng)[顏色圖可在wileyonlinelibrary.com查看]

 

 

12  |

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

圖6液滴數(shù)字PCR。通過(guò)ddPCR對(duì)miRNA的先進(jìn)定量始于cDNA合成。ddPCR可分為三個(gè)步驟，包括分配、PCR和讀取階段。首先，將反應(yīng)試劑分成大約20000個(gè)液滴，然后在完成PCR反應(yīng)后，讀取液滴熒光，并將其評(píng)估為陽(yáng)性或陰性結(jié)果。cDNA：互補(bǔ)DNA；ddPCR：液滴數(shù)字PCR；miRNA:microRNA；PCR：聚合酶鏈反應(yīng)[顏色圖可在wileyonlinelibrary.com查看]

 

探針、miRNA特異性正向和反向引物。通過(guò)將短RT啟動(dòng)序列退火到miRNA的3′端，該方法具有更好的特異性來(lái)區(qū)分相關(guān)

miRNA。此外，雙鏈莖結(jié)構(gòu)防止RT引物與前miRNA和其他長(zhǎng)RNA雜交（Z.Wang和Yang，2010）。

此外，還開(kāi)發(fā)了一種稱為“通用莖環(huán)引物”（USLP）的改良TSLP。與TSLP方法不同，TSLP方法要求為每個(gè)miRNA設(shè)計(jì)特定的干-環(huán)引物

USLP技術(shù)利用了在3′端的八個(gè)簡(jiǎn)并核苷酸

RT-底漆。因此，可以通過(guò)USLP方法在一個(gè)試管中同時(shí)進(jìn)行87個(gè)miRNA的RT（Yang等人，2014）。

 

 

 

 

1.     |微滴數(shù)字PCR對(duì)miRNA的先進(jìn)定量

miRNA相對(duì)定量的主要缺點(diǎn)是缺乏一致高效的參考基因（Campomenosi等人，2016）。

液滴數(shù)字PCR（ddPCR）平臺(tái)（Bio-Rad）基于

專有表面活性劑化學(xué)將PCR樣品分餾成20000 nl大小的液滴（圖6）。PCR擴(kuò)增發(fā)生在每個(gè)

單個(gè)液滴和PCR工作流程與TaqMan探針類似

基于實(shí)時(shí)PCR。PCR反應(yīng)完成后，讀取液滴以確定PCR陽(yáng)性液滴的比例。反應(yīng)中的目標(biāo)分子拷貝數(shù)根據(jù)

泊松分布假設(shè)（Huggett等人，2013年）。ddPCR的優(yōu)點(diǎn)是無(wú)需參考基因的先進(jìn)定量、檢測(cè)低豐度靶點(diǎn)的更高靈敏度以及增加對(duì)擴(kuò)增反應(yīng)中抑制劑存在的耐受性（Giraldez、Chevillet和Tewari，2018）。

ddPCR與qRT-PCR相比，在以下方面具有優(yōu)勢(shì)：

分析循環(huán)miRNA的技術(shù)性能和診斷潛力（Robinson等人，2018）。

 

 

 

 

1.     |miRNA表達(dá)分析的參考基因

 

盡管 qPCR 是一種強(qiáng)大的 miRNA 表達(dá)分析技術(shù)；然而，為了獲得高效的結(jié)果，需要通過(guò)合適的參考基因?qū)?shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。小核 RNA（如 U6）、小核仁 RNA（如 SNORD44）或特定 miRNA（如 miR-16）通常用作 miRNA 表達(dá)分析中的標(biāo)準(zhǔn)化基因。賊近證明，用于 miRNA 定量的五種常見(jiàn)候選參考基因的穩(wěn)定性從賊高到賊低分別為 SNORD48、SNORD44、5S、miR-16 和 U6。在賊近的另一項(xiàng)研究中，高通量分析表明，在 miR-24-3p 中，miR-151a-5p 和 miR-425-5p 穩(wěn)定表達(dá)并被證實(shí)是慢性乙型肝炎 miRNA 研究的賊合適的參考基因。因此，關(guān)于 miRNAs 表達(dá)分析的量化，必須驗(yàn)證每個(gè)實(shí)驗(yàn)設(shè)置中推定的歸一化因子的表達(dá)穩(wěn)定性。

 

 

 

 

10.   |結(jié)論

 

先進(jìn)個(gè)miRNA（lin-4）于1993年在秀麗隱桿線蟲中發(fā)現(xiàn)，不久之后在動(dòng)物、植物和一些病毒中也發(fā)現(xiàn)了它們。它們?cè)谵D(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)基因表達(dá)，并在細(xì)胞分化、增殖和存活中發(fā)揮重要作用。先進(jìn)個(gè)參與癌癥的miRNA（miR-122）在2002年發(fā)現(xiàn)，基因解碼發(fā)現(xiàn)它們是許多疾病的致病因素。迄今為止，試圖在各種疾病的體內(nèi)液體中中找到高效的miRNA生物標(biāo)記，具體而言，癌癥尚未轉(zhuǎn)化為臨床。幸運(yùn)的是，使用基于miRNA的治療方法治療癌癥和慢性HCV感染的I期臨床試驗(yàn)取得了有希望的結(jié)果

成功在這篇綜述中，我們提供了miRNA和分析方法的不同生物學(xué)方面的概述和更新。深度測(cè)序技術(shù)的出現(xiàn)導(dǎo)致越來(lái)越多的數(shù)據(jù)，現(xiàn)在生物信息學(xué)工具可用于管理和解決miRNA研究的一些新方面。

 

(責(zé)任編輯：佳學(xué)基因)