【佳學(xué)基因檢測】病例結(jié)果說明斜視為什么要做線粒體基因檢測？

《人體基因序列變化與疾病表征》中的斜視基因檢測

斜視患者眼外肌（EOM）的病理改變是正確診斷、阻斷遺傳以及個(gè)性化治療的必備要求。深入理解斜視患者肌細(xì)胞生物學(xué)特性可能為該類疾病提供新的治療思路。

斜視是指雙眼無法保持正常對位的狀態(tài)，其本質(zhì)是眼外肌協(xié)調(diào)功能障礙。當(dāng)支配眼球運(yùn)動(dòng)的六條肌肉中至少一條出現(xiàn)功能異常時(shí)，即可導(dǎo)致眼位偏斜。正常情況下，雙眼各六條眼外肌需對稱收縮并施加均衡作用力以實(shí)現(xiàn)協(xié)同運(yùn)動(dòng)。若這種力學(xué)平衡被破壞，則引發(fā)眼位異常。

斜視手術(shù)通過調(diào)整眼外肌位置來矯正眼位偏斜，通常在全身麻醉下進(jìn)行。鑒于眼位異常的病因復(fù)雜，當(dāng)非侵入性治療無效時(shí)需考慮手術(shù)治療。手術(shù)方式取決于斜視類型：內(nèi)斜視表現(xiàn)為眼球向內(nèi)偏轉(zhuǎn)（集合性斜視），外斜視則為眼球向外偏轉(zhuǎn)（分散性斜視）。通過松弛（減弱）或縮短（加強(qiáng)）眼外肌可實(shí)現(xiàn)矯正目的。經(jīng)專業(yè)眼科檢查及視軸測量后確定具體調(diào)整量。直肌后徙術(shù)通過將肌肉切斷并重新縫合于眼球更后端實(shí)現(xiàn)肌力減弱；直肌切除術(shù)和折疊術(shù)則用于增強(qiáng)肌力——前者切除部分肌肉后重新固定于原止點(diǎn)，后者通過肌肉折疊縫合于鞏膜實(shí)現(xiàn)強(qiáng)化。

ADP/ATP轉(zhuǎn)位酶1（ANT1）由SLC25A4基因編碼，作為線粒體內(nèi)膜通道蛋白，負(fù)責(zé)介導(dǎo)ADP進(jìn)入線粒體及ATP向外轉(zhuǎn)運(yùn)以供細(xì)胞能量代謝。ANT1還可參與構(gòu)成線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔，該結(jié)構(gòu)不僅調(diào)控分子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，還在細(xì)胞凋亡中起關(guān)鍵作用。ANT1編碼基因突變已被證實(shí)與肌肉及腦部退行性疾病相關(guān)，佳學(xué)基因檢測正通過致病基因鑒定基因解碼以揭示其致病機(jī)制。Coyne等研究發(fā)現(xiàn)，某些ANT1蛋白編碼基因突變并非直接影響其核苷酸轉(zhuǎn)運(yùn)功能，而是通過阻礙其他蛋白質(zhì)向線粒體的運(yùn)輸引發(fā)疾病，這一發(fā)現(xiàn)對理解線粒體蛋白相關(guān)疾病機(jī)制具有重要意義，或?qū)⒏淖兿嚓P(guān)治療策略。研究顯示，ANT1錯(cuò)義突變可導(dǎo)致顯性遺傳病，引發(fā)成人及遲發(fā)型常染色體顯性進(jìn)行性眼外肌麻痹（adPEO），臨床表現(xiàn)為上瞼下垂、眼肌麻痹及伴隨線粒體DNA（mtDNA）多重缺失的骨骼肌無力。顯性ANT1突變患者還可出現(xiàn)感音神經(jīng)性耳聾、陣攣性發(fā)作、雙相情感障礙、皮質(zhì)萎縮及癡呆等神經(jīng)系統(tǒng)癥狀。

目前關(guān)于斜視患者眼外肌mtDNA改變的基因檢測甚少，因此佳學(xué)基因解碼通過斜視手術(shù)患兒眼外肌mtDNA變異情況。佳學(xué)基因認(rèn)為斜視患者眼外肌功能失調(diào)可能部分源于mtDNA修飾，故本研究核心目標(biāo)是驗(yàn)證斜視兒童眼外肌是否存在mtDNA突變。納入標(biāo)準(zhǔn)為調(diào)節(jié)性斜視和嬰幼兒型斜視，排除標(biāo)準(zhǔn)為合并綜合征（如Moebius綜合征）、早產(chǎn)兒斜視及伴有神經(jīng)系統(tǒng)疾病的斜視病例。

佳學(xué)基因如何獲取高純度線粒體DNA?

采用Qiagen試劑盒從組織材料中分離mtDNA。具體步驟如下：

組織勻漿：將采集的肌肉切片組織（約50 mg）在勻漿緩沖液（含0.25 M蔗糖、10 mM EDTA、30 mM Tris/HCl，pH=7.5）中充分勻漿；

離心去核：勻漿液轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管，4℃、1000× g離心1分鐘，沉淀細(xì)胞核及碎片；

線粒體沉淀：取上清液于4℃、12000× g離心10分鐘，獲得線粒體沉淀；

線粒體懸浮：棄上清，沉淀重懸于緩沖液（含0.15 M NaCl、10 mM EDTA、10 mM Tris/HCl，pH=8.0），終體積50 μL；

堿裂解：加入100 μL新鮮配制的SDS-NaOH溶液（1% SDS中含0.18 M NaOH），渦旋混勻后冰浴孵育5分鐘；

中和反應(yīng)：加入75 μL預(yù)冷（約0℃）的堿性裂解液（3 M乙酸鉀/5 M乙酸體系：將11.5 mL冰乙酸加入60 mL 5 M CH?COOK溶液與28.5 mL H?O混合），渦旋輕柔混勻后冰浴5分鐘；

雜質(zhì)去除：4℃、12000× g離心5分鐘，收集上清液；

有機(jī)萃取：上清液中加入等體積酚/氯仿/異戊醇（25:24:1）混合液，渦旋劇烈震蕩后室溫12000× g離心2分鐘；

DNA沉淀：取水相轉(zhuǎn)移至新管，加入2倍體積預(yù)冷無水乙醇，混勻后室溫靜置15分鐘，室溫12000× g離心2分鐘獲得mtDNA沉淀；

純化：沉淀用1 mL 70%乙醇洗滌，減壓干燥1–3分鐘；

溶解：干燥后沉淀溶于含RNase的TE緩沖液（20 μg/mL RNase，pH=8.0的TE緩沖液：10 mM Tris-HCl，1 mM EDTA）。

佳學(xué)基因如何對線粒體DNA進(jìn)行NGS測序？

mtDNA的二代測序分析

通過實(shí)時(shí)定量PCR檢測mtDNA缺失水平及拷貝數(shù)，并定量分析ANT1、TYMS和PEO1的cDNA表達(dá)量。

PCR擴(kuò)增：

采用標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系（含無菌超純水、dNTP混合物、Taq DNA聚合酶、10×PCR反應(yīng)緩沖液及50 mM MgCl?）對ANT1、TYMS和PEO1基因進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5分鐘；35個(gè)循環(huán)（94℃變性1分鐘，59.1℃退火1分鐘，72℃延伸2分鐘）；72℃終延伸10分鐘。PCR產(chǎn)物經(jīng)12%聚丙烯酰胺凝膠電泳分析。

二代測序：

采用Illumina TruSeq PCR-free建庫試劑盒（美國圣地亞哥Illumina公司）對mtDNA進(jìn)行文庫構(gòu)建，使用Illumina HiSeq X測序平臺（美國圣地亞哥Illumina公司）檢測ANT1、TYMS和PEO1基因的缺失/重復(fù)突變。同時(shí)采用包含281個(gè)線粒體相關(guān)核基因的NGS panel篩查常見線粒體病相關(guān)突變。

突變驗(yàn)證：

所有變異均通過Sanger測序驗(yàn)證。PCR產(chǎn)物純化后直接測序，將檢測到的變異（包括錯(cuò)義突變、剪接位點(diǎn)突變及小片段插入缺失）與dbSNP數(shù)據(jù)庫、人類基因突變數(shù)據(jù)庫（HGMD）及文獻(xiàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行比對。對目標(biāo)變異先證者及其父母或兄弟姐妹進(jìn)行Sanger測序家系驗(yàn)證。

斜視致病基因鑒定基因?yàn)槭裁匆鼍€粒體基因檢測？

本研究共收集15例斜視手術(shù)患者的眼外肌樣本，其中：

• 內(nèi)斜視患者：8例（手術(shù)干預(yù)眼內(nèi)直肌）

• 外斜視患者：7例（手術(shù)干預(yù)眼外直?。?/p>

手術(shù)方案：

1. 外斜視組：切除內(nèi)直肌并進(jìn)行病理檢查

2. 內(nèi)斜視組：切除外直肌并進(jìn)行病理檢查

3. 大角度偏斜患者（偏斜角>10°）：除切除目標(biāo)肌肉外，同期行對側(cè)肌肉后徙術(shù)（圖1-2）

表1. 內(nèi)斜視手術(shù)患者（偏斜角>10°）的病理與基因檢測結(jié)果

（OS：左眼；OD：右眼；ANT1：ADP/ATP轉(zhuǎn)位酶1；C：胞嘧啶；G：鳥嘌呤；A：腺嘌呤；T：胸腺嘧啶）

注：2棱鏡度≈1°偏斜角

表2. 外斜視手術(shù)患者（偏斜角<10°）的病理與基因檢測結(jié)果

（OS：左眼；OD：右眼；ANT1：ADP/ATP轉(zhuǎn)位酶1；T：胸腺嘧啶；C：胞嘧啶；A：腺嘌呤；G：鳥嘌呤）

注：2棱鏡度≈1°偏斜角

 

眼外?。‥OM）組織病理學(xué)評估顯示，大部分肌纖維形態(tài)正常。在15例樣本中僅3例出現(xiàn)局灶性肌纖維萎縮特征：

1. 內(nèi)斜視手術(shù)患者（2例）：觀察到肌束邊緣部分肌纖維萎縮（表1）

2. 外斜視手術(shù)患者（1例）：發(fā)現(xiàn)肌束邊緣局灶性肌纖維萎縮（表2）

基因檢測結(jié)果：

• TYMP與PEO1基因：未檢測到突變

• ANT1基因：15例受檢者中12例存在點(diǎn)突變（缺失或堿基置換），具體表現(xiàn)為：

內(nèi)斜視組突變譜（表1）：

• 缺失突變：G缺失（3例）、C缺失（1例）、A缺失（1例）

• 復(fù)合變異：T缺失伴C>A置換（1例）

• 陰性結(jié)果：2例未檢出突變

  

外斜視組突變譜（表2）：

• 缺失突變：T缺失（3例）

• p

  堿基置換：C>A置換（2例）

• 復(fù)合變異：G缺失伴C>A置換（1例）

• 陰性結(jié)果：1例未檢出突變

  

線粒體基因檢測完善斜眼的致病基因鑒定基因檢測結(jié)果

眼外肌的解剖與生理特性

眼外?。‥OM）與其他骨骼肌存在顯著差異：

• 功能特性：EOM需在更廣的動(dòng)態(tài)范圍內(nèi)響應(yīng)，其結(jié)構(gòu)、功能、生化及免疫特性均不同于普通骨骼肌[4]。

• 微觀特征：

  • 肌纖維更細(xì)小，收縮速度可達(dá)其他骨骼肌的10倍以上

  • 神經(jīng)支配密度極高（神經(jīng)纖維與肌纖維比例為1:7，普通骨骼肌為1:100）

  • 含兩種特殊纖維類型：

    • 快顫纖維（由單一粗大運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元通過"en plaque"神經(jīng)肌肉接頭支配）

    • 慢張力纖維（由多個(gè)細(xì)小運(yùn)動(dòng)神經(jīng)通過"en grappe"末梢支配）

  • 富含彈性組織帶[6]

• 中間絲蛋白：結(jié)蛋白（desmin）、波形蛋白（vimentin）與巢蛋白（nestin）的分布模式顯著區(qū)別于體肌[6]

眼外肌的分子特異性

EOM具有獨(dú)特的分子特征：

• 肌球蛋白重鏈亞型：高比例快肌亞型（MyHC-eom）、張力型亞型（MyHC-sto）及持續(xù)表達(dá)的發(fā)育期亞型（MyHC-emb/MyHC-pn）[7]

• 鈣調(diào)控機(jī)制：肌漿網(wǎng)膜離子泵（SERCA）密度更高[7]

成人斜視患者的眼外肌改變

斜視的EOM病理機(jī)制尚未完全闡明，但已發(fā)現(xiàn)以下異常：

• 細(xì)胞增殖：內(nèi)直肌功能不足者中，活化細(xì)胞與衛(wèi)星細(xì)胞數(shù)量上調(diào)

• 氧化還原失衡：恒定性外斜視患者內(nèi)直肌的神經(jīng)元型一氧化氮合酶（nNOS）水平顯著升高，而過氧化氫酶表達(dá)降低[9]

• 本體感受器損傷：

  • 電子顯微鏡顯示斜視肌梭結(jié)構(gòu)紊亂，神經(jīng)成分消失，線粒體數(shù)量減少

  • 提示本體感覺傳導(dǎo)異?？赡軈⑴c斜視發(fā)病

• 細(xì)胞外基質(zhì)改變：

  • 間歇性外斜視患者內(nèi)直肌中聚集蛋白聚糖（aggrecan）含量隨年齡下降，且與運(yùn)動(dòng)功能相關(guān)

  • 恒定性外斜視者纖維連接蛋白（fibronectin）顯著低于對照組

兒童斜視的眼外肌特征

• 組織病理學(xué)：

  • 光鏡可見肌纖維形態(tài)異常、肌節(jié)破壞、膠原增生及空泡形成

  • 電鏡顯示肌絲紊亂、線粒體異常及糖原沉積

• 神經(jīng)肌肉接頭：

  • 先天性斜視患者遠(yuǎn)端肌腱連接處的神經(jīng)支配肌腱圓柱體（IMCs）結(jié)構(gòu)改變

  • 鞏膜肌腱連接處功能異?？赡苁顷P(guān)鍵病理環(huán)節(jié)

• 遺傳傾向：

  • 非綜合征性嬰兒型內(nèi)斜視可能與3p26.3–26.2和6q24.2–25.1染色體區(qū)域相關(guān)

斜視的分子遺傳學(xué)

• 基因表達(dá)譜：

  • 斜視EOM中604個(gè)基因表達(dá)異常：細(xì)胞外基質(zhì)相關(guān)基因上調(diào)，收縮相關(guān)基因下調(diào)

  • 胰島素樣生長因子1（IGF1）表達(dá)增加可能影響肌質(zhì)量與收縮動(dòng)力學(xué)

• 肌生成基因：MYOD1、MYOG等7個(gè)肌源性基因在斜視肌中表達(dá)普遍降低

• 線粒體機(jī)制：

  • ANT1基因突變可通過破壞mtDNA穩(wěn)定性導(dǎo)致肌肉及神經(jīng)系統(tǒng)退行性變

  • 本研究發(fā)現(xiàn)12/15例斜視兒童存在ANT1點(diǎn)突變，首次揭示mtDNA變異可能參與斜視發(fā)病

佳學(xué)基因的如何進(jìn)一步增加斜視基因檢測的準(zhǔn)確性？

需進(jìn)一步解析斜視與非斜視EOM的轉(zhuǎn)錄組差異，深化分子機(jī)制認(rèn)識以開發(fā)靶向治療。當(dāng)前NGS研究將持續(xù)評估m(xù)tDNA外顯子變異。